菌種是國家重要的生物資源，是生產(chǎn)、教學(xué)和科學(xué)研究的基本材料。食用菌和其他生物一樣，具有遺傳性和變異性，菌種保藏過程中，不僅要保持菌種不死亡、不被雜菌污染，更主要的是保持菌種遺傳性狀不發(fā)生或盡可能少發(fā)生變異。一個(gè)優(yōu)良的食用菌菌種被選育出來以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產(chǎn)性能，才能長(zhǎng)期在生產(chǎn)中使用。因此，菌種保藏在食用菌生產(chǎn)上具有重要的意義。為適應(yīng)群眾性生產(chǎn)的需要，使優(yōu)良高產(chǎn)菌株盡可能長(zhǎng)時(shí)間地在生產(chǎn)上發(fā)揮作用，并降低菌種的衰亡速度，防止雜菌污染，確保菌種的純正，現(xiàn)對(duì)食用菌菌種的保藏做一簡(jiǎn)介，并介紹幾種簡(jiǎn)單易行、實(shí)用效果好的菌種保藏方法。 

　　1 食用菌菌種保藏的目的意義及基本原理 

　　菌種保藏的主要目的在于能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持菌種的生存，保持菌種在遺傳、形態(tài)和生理上的穩(wěn)定性。對(duì)于生產(chǎn)用的商業(yè)品種，就是要保持其生產(chǎn)性狀的穩(wěn)定性。同時(shí)，還要保持菌種的物種獨(dú)立性，即使其免受其他微生物的侵染，保持純培養(yǎng)狀態(tài)。因此，它與新品種的選育具有同等的重要性。特別是在目前國內(nèi)菌種分散生產(chǎn)的情況下，菌種來源不清，菇農(nóng)之間菌種誤傳，某些菇農(nóng)和科研單位毫無根據(jù)地命名，使菌種出現(xiàn)同名異物或同物異名的現(xiàn)象，造成了菇農(nóng)選擇菌種的困難。而菌種的保藏和管理有利于這些問題的緩解。

　　菌種保藏的方法很多，但原理大同小異，均是通過低溫、干燥、缺氧和饑餓等手段來達(dá)到最大限度降低菌絲體的生理代謝。首先要挑選優(yōu)良純菌種，包括菌絲體和它們的孢子；其次，根據(jù)其生理、生化特點(diǎn)，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧等條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動(dòng)降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài)，從而延長(zhǎng)菌種生命以及使菌種保持原有的性狀，防止變異。不管采用哪種保藏方法，在菌種保存過程中要求不死亡、不污染雜菌和不退化。 

　　2 食用菌菌種保藏的方法 

　　2.1 試管斜面菌種系列保存方法

　　2.1.1 低溫定期移植保藏法。將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)，當(dāng)菌絲健壯地長(zhǎng)滿斜面時(shí)取出，放在3~5℃低溫干燥處或4℃冰箱中保藏，每隔3~6個(gè)月移植轉(zhuǎn)管1次，具體應(yīng)根據(jù)菌種特性決定。保藏時(shí)要注意環(huán)境濕度不能太高，以防霉菌通過棉塞進(jìn)入管內(nèi)。因此，若用棉塞，可用干凈的塑料薄膜或牛皮紙包扎棉塞，也可用無菌的白膠塞，并用石蠟涂封，即可減少污染的機(jī)會(huì)，也可防止培養(yǎng)基干燥。除草菇外，大多食用菌菌種都能采用此法保藏。

　　2.1.2 液體石蠟保藏法。取化學(xué)純液體石蠟裝于三角瓶中高壓滅菌后，放入40℃恒溫箱中，蒸發(fā)其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上，28～30℃下培養(yǎng)2～3d，證明無雜菌生長(zhǎng)方可使用。然后將母種接在斜面培養(yǎng)基上，當(dāng)菌絲在斜面上生長(zhǎng)豐滿后，將液體石蠟注在斜面上，注入量以高出斜面1cm為宜，使菌種與空氣隔絕，降低其新陳代謝能力。管口用滅過菌的白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，直立放在室內(nèi)干燥處或冰箱內(nèi)保藏。一般可保存1年以上，在低溫下保藏時(shí)間還可延長(zhǎng)。使用時(shí)從斜面上挑取菌絲少許，移接到新鮮斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)即可。由于菌絲體沾有液體石蠟而影響其生長(zhǎng)，需再經(jīng)1次移接才能恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

　　2.1.3 白膠塞封口保存法。選擇與試管口徑相符的白膠塞，用0.2%煤酚皂溶液洗滌，浸泡在酒精內(nèi)待用。當(dāng)試管斜面長(zhǎng)滿菌絲后，在無菌條件下拔去棉塞，取浸泡的白膠塞1個(gè)，通過火焰迅速塞入試管口內(nèi)，并用石蠟熔封。此法能達(dá)到與石蠟油封存相似的效果。用該法保存菌種可存活1～3年，但以每年移植1次為好。

　　2.1.4 蒸餾水保藏法。將8成熟試管菌種放在接種箱內(nèi)，注入蒸餾水，將培養(yǎng)基斜面全部淹沒至管口2cm。管口用白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，常溫下置于陰涼處立放，可以保藏1年左右。

　　2.2 非斜面固體菌種系列保存法

　　2.2.1 麥麩保藏法。將麥麩和水按0.80∶1充分拌勻后，裝入試管高壓滅菌，經(jīng)無菌檢查合格后接種，適溫下培養(yǎng)至菌絲體發(fā)育好后，將試管放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵將麥麩培養(yǎng)基內(nèi)水分抽干，然后移入盛有硅膠的干燥器內(nèi)，用凡士林密封在常溫下保存，可保藏3～5年。

　　2.2.2 麥粒保藏法。取優(yōu)質(zhì)小麥，淘洗后浸入20℃水中5h，撈出稍晾干，裝入試管，占管深1/3，高壓滅菌后趁熱搖散，冷卻后接入菌絲體，適溫培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿基質(zhì)后用石蠟封棉塞，置于冰箱或20℃以下干燥處，可保藏1～2年。

　　2.2.3 木屑保藏法。將闊葉樹木屑78％、麥麩20％、蔗糖1％、石膏粉1％，混合后加水拌勻，裝入試管滅菌后，接入斜面菌種，在適溫下培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)至試管2/3時(shí)用石蠟封棉塞，置低溫或常溫下保藏，一般可保藏1~ 2年。

　　2.2.4 稻草粉保存草菇菌種。草菇斜面菌種在2～4℃下保存2d便失去生活力，室溫下保存又因斜面培養(yǎng)基失水太快影響菌種存活。用稻草粉保存草菇菌種有其獨(dú)特的優(yōu)越性。其配方為稻草粉75%、麥麩22%、石膏粉1%、碳酸鈣1%、蔗糖1%、適量的水拌勻調(diào)濕。裝入試管高壓滅菌后按常規(guī)接種培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長(zhǎng)到試管2/3時(shí)，管口棉塞用石蠟熔封。常溫下保存至次年，不影響其活力和種性。

　　2.3 液體系列菌種保存法

　　2.3.1 生理鹽水保藏法。將待保藏的菌種接入馬鈴薯培養(yǎng)液中，在250mL三角形瓶中裝60mL培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)或每天搖動(dòng)5～10次，培養(yǎng)5～7d，然后將形成的菌絲球用無菌吸管吸入裝有５mL無菌生理鹽水試管中，每管移入4～5個(gè)菌絲球，塞上無菌白膠塞，用石蠟涂封，置低溫下可保藏1～2年。

　　2.3.2 營養(yǎng)液保存法。營養(yǎng)液的配方為馬鈴薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、硫酸銨微量。每支試管內(nèi)裝5mL，滅菌后用無菌吸管吸取生理鹽水保藏法深層培養(yǎng)的菌絲球4～5個(gè)于試管中，10~25℃的室溫下保存，可存活2～3年，其保存效果優(yōu)于生理鹽水保存法。不影響菌株形成子實(shí)體的能力。

　　2.3.3 無菌水保存法。先將培養(yǎng)好的斜面菌種切成小塊，連同培養(yǎng)基移入盛有適量無菌蒸餾水的試管中，然后用白膠塞封口，在20℃左右的室溫下保存。可存活1～2年。也可用磷酸緩沖液做保存液，其緩沖液的pH值視各保存菌株生長(zhǎng)的酸堿度而定。該法操作簡(jiǎn)便易行。

　　2.4 利用孢子保存菌種系列方法

　　2.4.1 濾紙片保藏法。取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）濾紙，剪成4.0cm×0.8cm的小紙條，平鋪在培養(yǎng)皿中用紙包裹進(jìn)行滅菌。采用鉤懸法收集孢子，讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中，白膠塞封口，再將保藏試管放入干燥器中1～2d，除去濾紙水分，然后低溫保藏。保存期可達(dá)２～10年。

　　2.4.2 沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗滌數(shù)次，過60目篩除去粗粒，加用1％稀鹽酸煮沸30min，以除去其中的有機(jī)質(zhì)，再用水沖洗至pH值達(dá)到中性，烘干備用。同時(shí)取非耕作層的瘦黃土或紅土，用水反復(fù)沖洗至中性，烘干碾細(xì)，過100目篩，將處理好的沙與土以2～4∶1混勻，然后分裝小試管內(nèi)，每管裝0.5g，高壓滅菌（1.5kg/cm2）3次，再干熱滅菌（160℃，2h）1次，待無菌檢驗(yàn)合格后方可使用。將已形成孢子的斜面菌種，在無菌條件下注入無菌水3mL，刮菌苔，制成菌懸液，再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內(nèi)，接上真空泵抽氣至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48h內(nèi)完成，以免孢子發(fā)芽。制備好的沙土管石蠟封口，在低溫下可保藏2～10年。

　　此外，還有甘油保藏法、枝條保藏法、超低溫液氮保藏法、冷凍真空干燥法等。

　　菌種保藏方法雖多，但都存在一些缺點(diǎn)，需進(jìn)一步進(jìn)行研究和探討。其中低溫定期移植保藏法雖然簡(jiǎn)單易行，不需特殊設(shè)備，但需幾個(gè)月轉(zhuǎn)管1次，轉(zhuǎn)管的次數(shù)多了，變異的可能性就增大，易造成菌種衰退。近年來人們找到了一種目前認(rèn)為最有效廣譜安全的保藏方法——超低溫液氮保藏法，在ATCC 用這種方法保藏雙孢蘑菇，9年后菌種仍保持穩(wěn)定，用于生產(chǎn)，產(chǎn)量、質(zhì)量無大變化，是目前國際上公認(rèn)為較為理想的菌種保藏方法，但用這種方法保藏菌種，需要液氨保藏罐設(shè)備，且液氯來源有限，費(fèi)用高，所以還不能普及推廣使用，只有少數(shù)科研院所使用。此外，還有冷凍真空干燥法，此法一般可保存10年以上，但成本較高。各菌種保藏中心、科研單位和生產(chǎn)單位可根據(jù)本地具體條件與生產(chǎn)實(shí)際選用菌種保藏方法，以確保菌種無退化或變異，保證科研、生產(chǎn)的正常進(jìn)行。 

　　3 菌種保藏效果的鑒定 

　　食用菌菌種保藏效果的鑒定的常用指標(biāo)是菌株的存活率和接種物成活率。我們認(rèn)為要確切地判斷一個(gè)菌株在保藏后是否已發(fā)生了變異，僅測(cè)菌株的這2項(xiàng)指標(biāo)是不夠的，還必須對(duì)其進(jìn)行全面仔細(xì)的連續(xù)觀察和測(cè)定，可從以下4個(gè)方面進(jìn)行考查：①生物學(xué)特征，如菌絲形態(tài)、顏色等；②對(duì)基質(zhì)分解能力，如走菌、吃料速度等；③遺傳特征，如相關(guān)酶的酶譜、酶活力等；④生產(chǎn)出菇能力，包括產(chǎn)量、質(zhì)量。通過經(jīng)常檢驗(yàn)，以確保不出現(xiàn)任何退化跡象的菌株取得菇農(nóng)的信賴。再者，就菌種保藏本身而言，通過保藏菌種的效果鑒定，可以對(duì)保藏方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)一步加以改善，使保藏體系更加完善。